一、概述
無細胞蛋白表達是一種體外重組蛋白質(zhì)表達技術(shù)也稱為無細胞蛋白質(zhì)合成技術(shù)（CFPS：Cell-freeproteinsynthesis），是指用含有蛋白合成必需的組分（核糖體，轉(zhuǎn)運RNA，氨酰合成酶，啟動/延伸/終止因子，三磷酸鳥苷，ATP，Mg2+和K+）的細胞裂解物在體外進行蛋白合成。
無細胞蛋白表達技術(shù)適用于制備各種類型的蛋白質(zhì)，包括難表達蛋白質(zhì)、毒性蛋白質(zhì)、復(fù)雜蛋白質(zhì)等。在藥物研究、生物制造和生命科學(xué)等領(lǐng)域中得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用，無論是研究、開發(fā)還是商業(yè)化應(yīng)用過程。目前無細胞蛋白表達主要應(yīng)用于藥物研發(fā)領(lǐng)域，例如抗體制備和生物藥物生產(chǎn)等。隨著人工智能技術(shù)的不斷發(fā)展，無細胞蛋白表達技術(shù)可以與人工智能算法結(jié)合，構(gòu)建計算機輔助的高通量生產(chǎn)系統(tǒng)，實現(xiàn)個性化、精準(zhǔn)的生物醫(yī)學(xué)治療。除此之外，還能夠應(yīng)用于其他領(lǐng)域，例如基因工程、環(huán)境保護和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等。隨著無細胞蛋白表達技術(shù)的不斷發(fā)展和人工智能技術(shù)的不斷進步，我們可以看到更多的新領(lǐng)域和新應(yīng)用出現(xiàn)，給生物科技行業(yè)帶來更多的機遇和挑戰(zhàn)。

圖1：典型無細胞蛋白表達的工作流程

二、技術(shù)原理
CFPS系統(tǒng)使用微生物、植物或動物的粗細胞裂解物中的成分來合成蛋白質(zhì)。常用的粗提取物是大腸桿菌、兔網(wǎng)織紅細胞、小麥胚芽（WGE）、昆蟲細胞或市售的純化重組元件系統(tǒng)（PURE）。CFPS系統(tǒng)的制備是一個簡單的過程，其中目的細胞過夜生長，稀釋，并進一步生長，直到光密度達到0.8至1.0，之后收獲細胞并超聲處理以提取細胞裂解物。然后將添加了必要輔因子、能量源、核苷酸、底物、氨基酸和tRNA的緩沖混合物添加到細胞提取物中，將其轉(zhuǎn)化為CFPS和無細胞轉(zhuǎn)錄-翻譯（TX–TL）系統(tǒng)。
CFPS系統(tǒng)的一般方案如圖3所示，該實驗使用含有必要細胞裂解物和DNA（線性或質(zhì)粒）的緩沖液，以及相關(guān)的能量源、核苷酸、氨基酸、鹽和輔因子，共同維持反應(yīng)以合成感興趣的產(chǎn)物。CFPS的合成產(chǎn)物可能因多種化學(xué)或生物部分而異，包括病毒、治療劑、抗體、化學(xué)品、生物燃料和蛋白質(zhì)。在合成此類產(chǎn)物時，CFPS系統(tǒng)相對于體內(nèi)系統(tǒng)具有直接優(yōu)勢，特別是考慮到該技術(shù)的相對速度、簡單性和有效性。通常，體內(nèi)系統(tǒng)是耗時的，并且往往比CFPS系統(tǒng)有更多的步驟。

 圖2：在單管中進行的CFPS系統(tǒng)的示意圖

三、技術(shù)細節(jié)
1
反應(yīng)體系
反應(yīng)體系的搭建是無細胞蛋白表達實驗的關(guān)鍵，為保證反應(yīng)的高效性和可重復(fù)性，需要精心構(gòu)建反應(yīng)體系，包括選用合適的模板、化學(xué)物質(zhì)、電解質(zhì)、抗氧化劑和各種工具等。
2
反應(yīng)條件
需要根據(jù)實驗要求調(diào)整反應(yīng)條件，包括溫度、離子強度、pH、反應(yīng)時間等多個方面，有利于促進核苷酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以及蛋白質(zhì)的自組裝和成型。
3
生產(chǎn)規(guī)模
無細胞蛋白表達技術(shù)可以擴大生產(chǎn)規(guī)模，提高生產(chǎn)效率，但需要保證反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，同時要保證反應(yīng)環(huán)境的清潔和消毒，以避免其他污染物的進入，從而影響蛋白質(zhì)的純度和活性。
四
技術(shù)優(yōu)勢
1
更高的蛋白質(zhì)表達量
傳統(tǒng)的活細胞蛋白表達技術(shù)受限于細胞本身的多方面因素，其表達的蛋白質(zhì)數(shù)量往往受到限制。而無細胞蛋白表達技術(shù)通過在體外底物濃度高的環(huán)境中進行合成反應(yīng)，不但避免了傳統(tǒng)活細胞表達所面臨的方方面面的限制，還能夠很好地控制反應(yīng)體系，從而獲得表達量更高的蛋白質(zhì)。
2
更快的表達速度
傳統(tǒng)活細胞蛋白表達需要細胞生長并達到最佳密度時才能進行蛋白質(zhì)表達，這個過程往往需要數(shù)天時間。而無細胞蛋白表達技術(shù)通常只需要數(shù)小時就能夠完成蛋白質(zhì)的表達，這個速度明顯快于傳統(tǒng)活細胞表達技術(shù)。
3
更精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)合成
無細胞蛋白表達技術(shù)在體外進行蛋白質(zhì)合成，能夠精確控制底物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)劑比例等參數(shù)，因此可以更加精準(zhǔn)地合成定制的蛋白質(zhì)，這對于研究和應(yīng)用來講具有重要意義。
4
更靈活控制
在無細胞蛋白表達技術(shù)中，可以使用分離的組分體系進行蛋白質(zhì)的合成，可以控制底物和反應(yīng)劑的比例，也可以在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下進行自定義的修飾，如蛋白質(zhì)標(biāo)記、藥效分析等。這些優(yōu)點使得無細胞蛋白表達技術(shù)更加靈活、可控，適用于更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。

 圖3：體內(nèi)細胞和體外無細胞蛋白質(zhì)合成比較