跨膜蛋白目前仍然是結(jié)構(gòu)生物學(xué)中具挑戰(zhàn)性的靶點之一。它們參與多種生物過程，包括光合作用、呼吸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子轉(zhuǎn)運和催化等。有文章報道，跨膜蛋白占大多數(shù)生物體蛋白質(zhì)組的 20% 至 30%，占藥物靶標(biāo)的 40% 以上。此外，全長跨膜蛋白的研究尤為重要，因為只有完整的三維結(jié)構(gòu)才能真實反映其生物學(xué)功能與藥物結(jié)合特性。

G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)、離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白等跨膜蛋白家族的異常與癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等重大人類疾病密切相關(guān)。這些疾病機制研究和藥物開發(fā)都依賴于對全長跨膜蛋白結(jié)構(gòu)的精確解析。例如，大量研究表明5-HT1A 受體（GPCRs超家族成員）與正常焦慮樣行為的發(fā)展有關(guān)，該受體是抗抑郁藥（如丁螺-環(huán)酮）和抗焦慮藥的重要作用靶點。

圖1:（A）α-螺旋和β-桶跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)；（B）跨膜蛋白示意圖：G 蛋白偶聯(lián)受體 （GPCR）、離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白、受體。

圖2：表達(dá)條帶

盡管跨膜蛋白研究意義重大，但其表達(dá)與純化一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)和藥物開發(fā)領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)面臨幾個關(guān)鍵瓶頸：

1.低表達(dá)水平：膜蛋白的天然豐度通常太低，無法分離出足夠量的物質(zhì)用于功能和結(jié)構(gòu)研究。在傳統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞）中，大量表達(dá)跨膜蛋白通常是非常困難的。

許多跨膜蛋白的高表達(dá)會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性，且其合成和插入膜的過程復(fù)雜，導(dǎo)致表達(dá)量極低，難以滿足結(jié)構(gòu)研究（如結(jié)晶）所需的大量純化蛋白。

2.溶解性與穩(wěn)定性問題：跨膜蛋白需要在脂質(zhì)雙分子層中正確折疊，其疏水跨膜區(qū)在細(xì)胞質(zhì)中易形成聚集體，導(dǎo)致錯誤折疊和非功能性蛋白。

3.難以穩(wěn)定形式純化蛋白質(zhì)：表達(dá)量低和穩(wěn)定性問題直接導(dǎo)致了純化的困難。需要引入親和標(biāo)簽（如His-tag）并進(jìn)行多步純化，整個過程不僅得率低，而且蛋白容易在純化過程中降解。天然膜環(huán)境是通過其脂質(zhì)組成和理化性質(zhì)賦予膜蛋白相當(dāng)大的穩(wěn)定性。當(dāng)溶解在去垢劑中時，許多膜蛋白會迅速變性并經(jīng)常聚集從而無法純化。

無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)為克服上述瓶頸提供了創(chuàng)新性解決方案：

1.模擬跨膜環(huán)境：無細(xì)胞系統(tǒng)允許直接添加脂質(zhì)體、納米圓盤或去污劑等膜模擬環(huán)境，使跨膜蛋白在合成的同時就能進(jìn)入類膜結(jié)構(gòu)，極大提高了正確折疊率。

2.毒性蛋白的高效表達(dá)：由于無細(xì)胞系統(tǒng)不受細(xì)胞生長限制，可以高效表達(dá)對細(xì)胞有毒性的跨膜蛋白。

3.靈活調(diào)控氧化還原環(huán)境：跨膜蛋白二硫鍵的形成對其穩(wěn)定性至關(guān)重要。無細(xì)胞系統(tǒng)可精確調(diào)控氧化還原電位，促進(jìn)二硫鍵的正確形成，而無需復(fù)雜的細(xì)胞工程改造。

4.快速篩選表達(dá)條件：無細(xì)胞系統(tǒng)可實現(xiàn)高通量條件優(yōu)化，快速篩選適合特定跨膜蛋白表達(dá)的脂質(zhì)/去污劑組合、分子伴侶和緩沖條件，大幅縮短優(yōu)化周期。

5.同位素標(biāo)記簡化：對于NMR研究，無細(xì)胞系統(tǒng)可輕松實現(xiàn)特異性氨基酸標(biāo)記，解決了全長跨膜蛋白同位素標(biāo)記的難題。

圖3:體內(nèi)和體外生產(chǎn)重組膜蛋白的一般策略

圖4:人 STING1 全長蛋白表達(dá)條帶

1. Carpenter EP, Beis K, Cameron AD, Iwata S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Curr Opin Struct Biol. 2008;18(5):581-586. doi:10.1016/j.sbi.2008.07.001.
2. Ryu H, Fuwad A, Yoon S, et al. Biomimetic Membranes with Transmembrane Proteins: State-of-the-Art in Transmembrane Protein Applications. Int J Mol Sci. 2019;20(6):1437. Published 2019 Mar 21. doi:10.3390/ijms20061437.
3. Garcia-Garcia, Alvaro L et al. “5-HT(1A) [corrected] receptors in mood and anxiety: recent insights into autoreceptor versus heteroreceptor function." Psychopharmacology vol. 231,4 (2014): 623-36. doi:10.1007/s00213-013-3389-x.
4. Bill RM, Henderson PJ, Iwata S, et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nat Biotechnol. 2011;29(4):335-340. doi:10.1038/nbt.1833.
5. Rauh, Oliver et al. “Combining in vitro translation with nanodisc technology and functional reconstitution of channels in planar lipid bilayers." Methods in enzymology vol. 652 (2021): 293-318. doi:10.1016/bs.mie.2021.02.003.

6. Schwarz, Daniel et al. “Production of membrane proteins using cell-free expression systems." Proteomics vol. 8,19 (2008): 3933-46. doi:10.1002/pmic.200800171.