七次跨膜蛋白

四次跨膜蛋白

膜蛋白表達(dá)條件快速優(yōu)化

珀羅汀生物受客戶委托，篩選某膜蛋白最佳表達(dá)條件。研發(fā)人員通過(guò)PCR擴(kuò)增，分別構(gòu)建目的蛋白表達(dá)模板（A組）、C端融合GFP的目的蛋白表達(dá)模板（B組），采用專研的針對(duì)膜蛋白的CFPS體系（即PLDK002試劑盒來(lái)源體系），并設(shè)置是否添加某去垢劑【1】，快速篩選該蛋白的最佳表達(dá)條件。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

注：【1】該去垢劑是依據(jù)珀羅汀生物膜蛋白表達(dá)案例庫(kù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選出。

圖1融合GFP的目標(biāo)膜蛋白在照膠儀下發(fā)出綠色熒光

圖2 目標(biāo)膜蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖

經(jīng)考染、脫色后，如圖2所示，未融合GFP的目標(biāo)膜蛋白（A1、A2組）同樣在上清液中可溶表達(dá)！此外，分別對(duì)比A1、A2組與B1、B2組可以發(fā)現(xiàn)，添加去垢劑可促進(jìn)該膜蛋白的可溶表達(dá)。

超高難度八聚體膜蛋白成功表達(dá)

圖4 目的蛋白表達(dá)鑒定

（channel 1：空白對(duì)照；channel 2~10：不同方案的目的膜蛋白表達(dá)情況；channel 11：marker）

選擇PLDK002-C（channel 3）和PLDK002-I（channel 9） 的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系進(jìn)行第二輪優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示，channel 5的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)方案可以正確表達(dá)該MspA的單體與多聚體。

圖5 MspA目的蛋白表達(dá)鑒定

全長(zhǎng)CLDN 18.1膜蛋白可溶表達(dá)

珀羅汀生物研發(fā)人員構(gòu)建了融合標(biāo)簽的CLDN 18.1質(zhì)粒，選用多種珀羅汀無(wú)細(xì)胞表達(dá)條件體系，進(jìn)行表達(dá)測(cè)試。如圖2、圖3所示，CLDN 18.1在不添加表面活性劑的無(wú)細(xì)胞體系中主要表達(dá)在沉淀中；通過(guò)在無(wú)細(xì)胞反應(yīng)體系中加入表面活性劑，CLDN 18.1即實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)。經(jīng)純化，成功獲得80%以上純度的CLDN 18.1蛋白。

圖2 CLDN 18.1在珀羅汀無(wú)細(xì)胞體系表達(dá)后SDS-PAGE

（S為上清樣，P為沉淀樣）

圖3 CLDN 18.1在珀羅汀無(wú)細(xì)胞體系表達(dá)并經(jīng)Ni珠親和純化后SDS-PAGE（E為洗脫樣）