恥垢分枝桿菌毒素蛋白（Mycobacterium smegmatisporin A, MspA）是一種通道形成蛋白，用于小分子和水的通道。MspA是分子量 20 kDa 的單體蛋白構(gòu)建的同源性八聚體，其形狀為“八"字形杯狀結(jié)構(gòu)。MspA長度大約 1 nm，具有大約1 nm的寬度收縮區(qū)，兩側(cè)有明顯較大的直徑區(qū)域。

MspA 擁有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在 100℃的溫度下活性能耐受 30 min，在80℃的2% SDS條件中培養(yǎng)15分鐘依然可以保持良好的通道活性，在 pH 0~14 的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，同時MspA具有易于進(jìn)行多位點突變修飾。

圖1 MspA突變體的結(jié)構(gòu)與表達(dá)

圖2 納米孔測序原理

MspA作為一種具有錐形結(jié)構(gòu)的八聚體孔道蛋白，通過引入突變開發(fā)工程化MspA孔道，可以實現(xiàn)多種單糖直接區(qū)分，說明MspA是核酸與多種生物大分子檢測的有力品。

MspA是細(xì)菌細(xì)胞外膜上親水性營養(yǎng)溶質(zhì)的主要通道，負(fù)電性密集的收縮區(qū)具有天冬氨酸的雙圈結(jié)構(gòu)，能夠與陽離子結(jié)合。使用合適的通道阻斷劑可以堵塞MspA蛋白孔，則親水性營養(yǎng)溶質(zhì)不能輸送進(jìn)細(xì)菌體內(nèi)，造成細(xì)菌休眠，同時可以破壞細(xì)胞外壁的穩(wěn)定性，增強(qiáng)細(xì)菌的抗生素易感性，對于疾病治療具有重要作用。

圖3 MspA實現(xiàn)單糖區(qū)分

圖4 目的蛋白表達(dá)鑒定

（channel 1：空白對照；channel 2~10：不同方案的目的膜蛋白表達(dá)情況；channel 11：marker）

之后，選擇PLDK002-C（channel 3）和PLDK002-I（channel 9） 的無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系進(jìn)行第二輪優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示，channel 5的無細(xì)胞蛋白表達(dá)方案可以正確表達(dá)該MspA的單體與多聚體。

圖5 MspA目的蛋白表達(dá)鑒定

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1. Tom Z, Mikhail P,et al.Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore. PNAS,doi 10.1073 (2008).

2. SY Zhang,ZY Cao,et al.A Nanopore-Based Saccharide Sensor. Angew.Chem. Int.Ed.doi.org/10.1002/anie.202203769 (2022).

3. Ayomi S. Perera,et al. Channel Blocking of MspA Revisited. Langmuir.doi.org/10.1021/la3037296 (2012).